Wie störend die Photoblau-Mikroskopie EurekAlert! Wissenschaftsnachrichten

BILD: Konfokale Fluoreszenzbilder von Glasoberflächen, die mit dem Cyaninfarbstoff Alexa Fluor 647 (a) und CF660C (b) sowie mit dem Carborhodaminfarbstoff ATTO647N (c) nach Lichtentwicklung bei 568 Nanometern bedeckt sind … siehe Mehr

Bildnachweis: Team Markus Sauer / Universität Würzburg

Die neuesten Entwicklungen in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen es, einzelne Moleküle in Zellen oder Molekülkomplexen mit einer räumlichen Auflösung von bis zu 20 Nanometern abzubilden. Unter bestimmten Bedingungen gibt es jedoch einen Effekt, der die Ergebnisse verfälscht: Das verwendete Laserlicht kann dazu führen, dass sich in der Probe viele reaktive Sauerstoffmoleküle bilden. Es kann dann die fluoreszierenden Farbstoffe so stark schädigen, dass sie nicht mehr fluoreszieren. Unter Mikroskopie-Experten ist dieser Effekt als Photobleichen bekannt.

Verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe können jedoch auch durch Photobleichen so transformiert werden, dass sie Licht mit kürzeren Wellenlängen absorbieren. “Ein zuvor roter fluoreszierender Farbstoff leuchtet dann grün. Die Fluoreszenz wird bei der Wellenlänge in den blauen Bereich verschoben. Deshalb wird dieser Effekt als Photoblue bezeichnet”, erklärt Professor Markus Sauer, Experte für hochauflösende Mikroskopie des Julius-Maximilians-Biozentrums. Universität Würzburg (JMU) in Bayern.

Erste genaue Beschreibung von Photoblue

Das Sauer-Team präsentiert nun erstmals den genauen molekularen Mechanismus von Photoblau für Cyaninfarbstoffe wie Cy5. Natürliche Methoden. Dr. Martin Schnermann vom Zentrum für Krebsforschung in Frederick (USA) ist ebenfalls an der Veröffentlichung beteiligt.

“Weil wir den Mechanismus so genau verstanden haben, konnten wir durch einfache Zusätze wie Vitamin C Lichtbläschen verhindern oder durch Zugabe eines Katalysators erhöhen”, sagt Markus Sauer.

Es kann sehr wichtig sein, Fotoblau zu vermeiden. Obwohl der Effekt nur wenige Prozent des verwendeten Farbstoffs beeinflussen kann, kann er dennoch zu Fehlern oder Fehlinterpretationen der Mikroskopie führen, beispielsweise bei Energieübertragungsexperimenten (FRET). Dies liegt daran, dass die umgewandelten Farbstoffe mit der gleichen hohen Empfindlichkeit wie die Ausgangsprodukte nachgewiesen werden.

Einfache Puffer verhindern Fotoblau

“Unsere Ergebnisse zeigen, welche Farbstoffe betroffen sind und wie Photoblau durch einfache Pufferzugaben verhindert werden kann”, fasst Sauer den Inhalt des Natürliche Methoden Papier. “Sie zeigen aber auch, wie Photoblau möglicherweise für die Fluoreszenzbildgebung und zum Nachweis einzelner, spezifisch umgewandelter Farbstoffmoleküle verwendet werden kann.”

Genau das plant Sauers Team als nächstes: Das Photoblueing muss weiterentwickelt werden, um unter anderem einzelne bakterielle und virale Partikel in Infektionsprozessen gezielt nachweisen zu können.

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